顕微鏡関係

光学顕微鏡の使い方

パソコンの電源を入れる

PWなし

左上から4番目のAxioVisionをダブルクリック

BF(左側)の上から2番目のライブをクリック

露出、ホワイトバランスを調整

ライブのプロパティでさらに調整

目安として・・・ 40倍、光量9で 緑藻 ディスプレー　-0.53, 1.11, 0.40 調整　13ms, 134% 色調　0.77, 1.30, 0.93

スケールをチェック(倍率を変えたときはスケールも変える)

スナップ

スケールバーを入れる

保存

カメラは実体でも倒立でも使用できるが、移動させマウントが異なるので注意!!!

 

蛍光観察

DAPIで核染色

  1. 酢酸:エタノール=1:3で混合(1.5mlエッペンに酢酸200μ:エタノール600μ)を作り、そこに藻体を入れる　2時間待つ　70%エタノールに置換し冷蔵庫で保管
  2. 70%エタノールを捨てて、DWで3回洗う
  3. ロシュ製品のDAPI(10mgをDW5mlで溶かして-20℃保存)をDWで2000倍に薄めて使用(2mlDWに1µlDAPI液)。5分待つ。
  4. UVで観察

ミスラマイシンで核染色

  1. 酢酸:エタノール=1:3で混合(1.5mlエッペンに酢酸200μ:エタノール600μ)を作り、そこに藻体を入れる　2時間待つ　70%エタノールに置換し冷蔵庫で保管
  2. Bufferの作製(0.1M クエン酸1.78mlと0.2M Na2PO4 8.22mlをコニカルチューブで混合し、MgCl2・H2O 24mgを入れる)
  3. 70%エタノールを捨てて、DWで3回洗う
  4. Bufferを400μ入れ、そこにミスラマイシン(250μg/mlに調整済み)を100μ入れる

生体での細胞壁染色

  1. 0.01% Fluorescent Brightener 28 海水溶液を作り、オートクレーブ　　(FB 20mg+SW 200ml)
  2. 藻体を綺麗に洗浄し、シャーレにいれる。
  3. 適当量FB海水溶液を入れ、30-60mjn待つ。
  4. 2-3回、滅菌海水で洗浄
  5. UV下で1つづつ観察
  6. 24穴シャーレに入れ培養
  7. 1日おきに観察

FDA染色生存率カウント法

細胞内に取り込まれた無色透明のFDAは、エステラーゼにより分解され、紫外線により蛍光を発する。これを蛍光顕微鏡ブルー励起で観察して、細胞の生死を判定する方法。高等植物などでよく用いられている。

<手順>

  1. FDA 5mgを100%アセトン1mlに溶かし、エッペンチューブに (50μlずつ) 分注。このストック染色液は、フリーザー (-20℃) 内で保管しておく。
  2. 使用直前、ストック染色液5μl、培地495μlをエッペンチューブ中で混合し、100倍に希釈する。
  3. 試料を染色液に入れ、室温で20分置いた後、蛍光顕微鏡で観察する。
  4. ノマルスキーのU?DICTをはずす。蛍光ミラーはB励起の狭域「NIBA」でも広域「WIB」でもOK。広域「WIB」の方が葉緑体の自家蛍光が見えて,死細胞がカウントしやすい。

 

TEMでの観察

  • 前固定　　4℃　2時間
  1. 10%グルタールアルデヒド　100ml25%グルタールアルデヒド 40mlにDW　60ml加えた
  2. 0.2Mカコジル酸Na(毒物保管庫)+0.2% CaCl2(+海産種の場合,4%NaCl) 0.2M　100ml

ビーカーに50ml　DW, カコジル酸Na　4.28g入れ,溶けたら,0.2% CaCl2になるように200mg加え,pH7.2に合わせ,100mlにfill up(+海産種の場合, NaCl 4gを最後に加える)

ディスポシャーレもしくはエッペンチューブに①を5ml入れ,そこに②を10ml入れ,そこに培養している水(海水,汽水,淡水)を同量の5ml入れ,そこに藻体を入れる。その後,藻体を5mm角に小さくする。

海産の場合,30分後,エッペンチューブに①を250μ,②を500μ,DWを250μ入れ,混ぜ,そこに,切った藻体を入れる。

(最終濃度:2.5%グルタールアルデヒド,0.1Mカコジル酸Na,0.1% CaCl2(+海産種の場合,2%NaCl))

  • 洗浄 10分毎　6-8回 0.1% CaCl2　 0.1M カコジル酸緩衝液　(+海産種の場合,2%NaCl) 廃液はカコジル酸廃液ビンへ
  • アルデヒドはOsO4の還元剤となりうるので洗浄は十分に行なう。
  • 後固定 4℃　2時間 洗浄液を抜き,約20μ残し(全量取った場合は加え),そこに4%OsO4を専用ピペットで入れる。

(最終濃度:　1-2% OsO4,0.1% CaCl2,0.1M カコジル酸緩衝液)

OsO4は揮発性の高い毒物!必ず,手袋をしてドラフト内で作業すること。

廃液回収ができないため,必要量のみ使うこと。

  • 洗浄 10分毎　2回

0.1% CaCl2 0.1M カコジル酸緩衝液　(一次廃液はOsO4専用廃液へ,二次廃液はカコジル酸廃液へ)

  • バッファーを水に置換
  • アセトン脱水

30 – 50 – 70 – 80 – 90 – 100% アセトン　氷上　30分

100% アセトン 室温　30分　2回

アセトン廃液は,ディスポカップにキムワイプを入れ,揮発させる

  • 樹脂作成　手袋・室内

はかりにアルミを敷き,ディスポカップを置き, reZERO

ERL 10g

DER 6g

NSA 26g

をディスポスポイトで計り入れ,樹脂専用スターラーで15～20分撹拌

S1 0.4gを慎重に計り入れ,樹脂専用スターラーで15～20分撹拌

樹脂専用スターラーはアセトンで拭いて保管

・樹脂誘導 (樹脂を無水アセトンに溶かす)

20 – 40 – 60 – 80% Spurr 樹脂　室温　60分

100% Spurr 樹脂 2晩

樹脂20%からover night可能

  • 重合

直径2cmの円柱状プラスチック入れに高さ2mmぐらい藻体入り樹脂を入れ

70℃　8時間以上

余った樹脂で鉄砲玉を作成

トリミング

新しい両刃を半分にして,エタノールで拭く。

実体顕微鏡下で1mm角に切り取り,鉄砲玉の上にアロンαで貼り付ける。

(メンディングテープを貼って切ると飛ばなくてすむ)

グリッドに被膜を張る

腰高シャーレにDWを入れる。

縁が研磨してあるスライドグラスをキムワイプで拭く。

Formvar 0.5 % (二塩化エチレンでうすめたもの:減っていれば線まで二塩化エチレンを加える)にスライドグラス半分ぐらいまで浸し,あげて,ビンの中で20秒待つ。

外に出して乾燥させる。

カッターで縁をしゃしゃっと削り,四角くカッターで切れ目を入れる。

斜めにして,ゆっくりDWに入れる。最初の部分は,1分ぐらい待つ感じ。膜がはがれてきたら,ゆっくりスライドクラスをDWに入れていき,最後は落とす。

被膜の上にグリッドをのせていく。

パラフィルムをかぶせ,回収する。