タンパク質関係

タンパク質抽出プロトコル

・・・準備段階・・・

藻体は水気を取って,コニカルチューブにいれ,液体窒素で瞬間冷凍し,-80で保存

可溶可バッファー Triton-X, Tween 20を準備

 2.2%TritonX-100可溶化buffer


  • 1M Tris-Cl (pH 7.5) 250μl [50mM]
  • 2-メルカプトエタノール 110μl [0.31M]
  • 10% TritonX-100 1.1ml [2.2%(v/v)]
  • 137mM PMSF 292μl [8mM]
Fill up to 5ml (DW)


Tween-20 (Polyoxethylene(20)sorbitan monolaurate)可溶化buffer

  • 1M Tris-Cl (pH 7.5) 250μl [50mM]
  • 2-メルカプトエタノール 110μl [0.31M]
  • 5% Tween-20 1ml [1%(v/v)]
  • 137mM PMSF 292μl [8mM]
Fill up to 5ml (DW)


L solution

  • Tris 36.4g [1.5M]
  • ・10%SDS 8ml [0.4M]
Fill up to 200ml (DW)

 上記の試薬をDWに溶かし200ml近くまでfill upし、conc.HClを用いてpH8.8に調整した。


M solution

  • Tris     10g [0.5M]
  • 10%SDS 8ml [0.4M]
Fill up to 200ml (DW)

上記の試薬をDWに溶かし200ml近くまでfill upし、conc.HClを用いてpH6.8に調整した。


N solution

  • Acrylamide  60g [30%(w/v)]
  • N,N’-Methylene-bis-acrylamide 2.16g [1.08%(w/v)]
Fill up to 200ml (DW)
  • 10% Ammonium peroxdisulfate (APS)
  • -20℃で保存。
  • 10×Running buffer
  • Tris       30g[250mM]
  • Glycine 144g[1.92M]
SDS 10g[1%(w/v)]

Fill up to 1 liter (DW)


☆ゲル装置の組み立て☆

  • ゲル板,コーム,ゴムバンドを洗浄(手袋を忘れずに)。
  • DWをかけ,キムワイプで拭き,新しいキムタオルの上に置く。
  • Gel moduleにガラスプレートとスペサーをセットする(凹板を下側にする)。
  • 両サイドをクランプで挟み、スクリューを均等に締める。シーリングプレートを起こし、つまみをクランプの奥の窪みにはめ込む。
  • コームをさし,その2cm下に矢印シールをはる。
  • 70%エタノールをいれてみて漏れがないかチェック。

☆ゲルの作製☆


  • Runningゲルの材料を三角フラスコにいれ,手で回しまぜる(下表参照)。
  • 脱気はせずに,そのまま矢印シールのちょい上まで流し込む。
  • 70%エタノールを入れ,カバーする。
  • ラップで上部をつつみ,37℃, 15min.
  • Stackingゲルの材料を三角フラスコにいれ,手で回しまぜる(下表参照)。
  • ゲル上部の70%エタノールを捨て,ろ紙でしっかりと吸い取る。
  • Stackingゲルをぎりぎりまでいれ,静かにコームを差す(泡がないか確認)。
  • ラップで上部をつつみ,37℃, 20min.
 

7.5% Running gel

一枚分 二枚分
DW 4.976ml 9.952ml
L solution  2.49ml  4.976ml
N solution 4.976ml
10% APS 39.8μl 79.6μl
TEMED 10μl 20μl

10% Running gel

一枚分 二枚分
DW  4.1ml 8.2ml
L solution  2.49ml  4.98ml
N solution  3.3ml  6.6ml
10% APS 39.8μl 79.6μl
TEMED 10μl 20μl
 

12.5% running gel

一枚分 二枚分
DW 3.39ml 6.78ml
L solution 2.49ml 4.98ml
N solution 4.17ml 8.34ml
10% APS 39.8μl 79.6μl
TEMED 10μl 20μl
 

15% running gel

一枚分 二枚分
DW 2.488ml 4.976ml
L solution 2.488ml 4.976ml
N solution 4.976ml 9.952ml
10% APS 39.8μl 79.6μl
TEMED 10μl 20μl

stacking gel

一枚分 二枚分
DW 2.98ml 5.96ml
M solution 1.26ml 2.52ml
N solution 0.77ml 1.54ml
10% APS 16.8μl 33.6μl
TEMED 10μl 20μl

☆タンパク質の抽出☆

  • 乳鉢に0.2gの藻体をとり,氷上で可溶可バッファーを800μl入れ粉砕する。
  • 5mlチューブに全量入れ,3000rpm, 10min
  • 上澄みを別のチューブに全量入れ,氷上
 

☆ローディング☆

4×sample buffer

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 5ml [0.5M]

SDS 2.4g [12%(w/v)]

Glycerol 8ml [40%(v/v)]

2-mercapto ethanol 4ml [20%(v/v)]


Bromophenol blue 0.8mg [0.004%(w/v)]

Fill up to 20ml (DW)


  • Gel moduleのシーリングプレートを開いて、重合していないゲル溶液をろ紙でふき取る。
  • シーリングプレートのつまみをクランプの下側の窪みにはめ込む。
  • 抽出液15μl, 4xバッファー5μl(updpwn)をPCRチューブにとり,pipetting。
  • 100℃, 5minでヒートショック,スピンダウン(机上)。
  • コームをゆっくりはずし,細く切ったろ紙でcellをきれいに。
  • Runningバッファーを作製。
  • 外側に1/3ぐらいRunningバッファーをいれる。
  • Gel moduleを装着(下に泡をいれないように)。下に泡が入った場合にはシリンジを用いて泡を取り除く。
  • 内側にRunningバッファーをいれる。
  • 16μlをローディング。マーカは5μl
  • 1枚で10mA,裏表で20mA、下ゲルに達したら1枚で20mA,裏表で40mA
 

☆染色☆

  • バンドが下まで達しsample bufferがrunning bufferに出だしたところで,0に戻し,電源off。
  • ガラス板をスパチュラではずし,Stackingゲルを切り取る。
  • タッパにDWを入れ,そこにDWをかけながらゲルを流し入れ10minしんとう。
  • DWをすて, CBB染色液をいれ,30minしんとう。
  • 染色液を保存用ビンに戻し,脱色液を適量入れ,キムワイプを入れ30minしんとう。
  • 廃液を廃液入れに入れ,タッパを洗浄。
 

染色希釈・脱色液

特級MeOH 300ml [30%(v/v)]


特級Acetic Acid 100ml [10%(v/v)]

Fill up to 1 liter (DW)


10×染色液

特級MeOH 30ml [30%(v/v)]


特級Acetic Acid 10ml [10%(v/v)]

Fill up to 100 ml (DW)

→200ml容ビーカーに調整し250mgのCoomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)を入れて溶解させる。


☆ゲル乾燥☆

  • アッセンブリーテーブルにボトムフレームと水でぬらしたセロファンをのせる。
  • セロファンの上にゲルをのせる。
  • ゲルの上にもう一枚水でぬらしたセロファンをのせる。このとき空気が入らないように注意すること。
  • トップフレームをのせてクランプで締める。
  • ドライヤーの中にフレームを入れる。タイマーを1~2時間にセットしてスタート。

☆ブロッティング☆

Transfer buffer

Tris 3.0g

Glycine 14.4g

SDS 1.0g


特級MeOH     200ml

Fill up to 1liter(DW)


  • ブロットモジュールの電極版をDWで洗浄する。
  • ゲルと同じサイズのブロッティングペーパーをゲルの枚数×2枚準備する。カットしたペーパーはトランスファーバッファーに浸しておく。
  • メンブレンを同じサイズにカットする。ニトロセルロース、ナイロンメンブレンはDWにつけた後、PVDFメンブレンはメタノールにつけた後に2~5分間トランスファーバッファーに浸しておきます。下図のようにダクロンスポンジ(a,f)、ブロッティングペーパー(b,e)、ゲル(c)、メンブレン(d)を重ねる。2枚のゲルのブロッティングを同時に行う場合は、fで示した2枚のダクロンスポンジの間にb~eを重ねる。

  メンブレンとゲルの間に空気が入らないように注意する。






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(赤:陽極、黒:陰極)
  • 陰極の上にa~fをのせ、ブロットモジュールを閉じタブを奥までしっかりとはめ込む。
  • ブロットモジュールを300~350mlのトランスファーバッファーで満たす。
  • ブロットモジュールを下部バッファータンクに設置する。下部バッファータンクを2~1.7Lの室温もしくは4℃に冷却したDWで満たす。
  • 定電流300~400mAで1~2時間行う。