人工海水(SF-1)の作り方
・25L容器にクラッシュアイスを入れ10回振り水道水で3回洗浄でDWをかける(汚れがひどい場合→先生)
・DWを22L線まで入れ、人工海水(SF-1)の粉をこぼさないように1袋入れ、エアレーションで数日撹拌し,濾過器で濾過する
・1Lボトルにクラッシュアイスを底から3cmほど入れ、100回ほど上下左右 水道水で3回洗浄し、DWをかける
・海水をボトルに入れ、オートクレーブ(121℃20分)
PESI, PESの作り方 1Lの場合
PESI medium 1L
・1LビーカーにDWを300mL入れ、スターラーを入れ、攪拌機で回す
・以下の順で加える
Tris hydroxymethyl aminomethane ①—- 5.0 g
NaNO3 ②——– 3.5 g
Na2-glycerophosphate ③——– 500 mg
Fe stock solution ——— 250 ml
P-2 metal mix ———- 250 ml
KI stock solution (0.1 mg / ml) —— 10 ml
・pHを7.8に調整→DW 1000 mlにメスアップ→オートクレーブ(121℃,20分)→4 ℃で冷蔵保存
Fe stock solution 1L
・1LビーカーにDWを500mL入れ、スターラーを入れ、攪拌機で回す
・以下の順で加える
Fe(NH4)2(SO4)2・6H2O ⑤——-702 mg
Na2-EDTA・2H2O ④——- 660 mg
・DWで1Lにメスアップ→4 ℃で冷蔵保存
PII Metal Mix 1L
・1LビーカーにDWを900mL入れ、スターラーを入れ、攪拌機で回す
・以下の順で解けたら加え解けたら加える
Na2-EDTA・2H2O ④————1g
H3BO3 ⑥——1.14g
FeCl3・6H2O ⑦——49mg
MnCl2・4H2O ⑧——164mg
CoSO4・7H2O水溶液(1mg/ml) ⑨——4.8ml
ZnSO4・7H2O水溶液(10mg/ml) ⑩——2.2m
・DWで1Lにメスアップ→4 ℃で冷蔵保存。
KI stock solution
・100ml DWに20mgのKIを溶かし,200mlにメスアップ→4 ℃で冷蔵保存
PES medium
・1LビーカーにDWを300mL入れ、スターラーを入れ、攪拌機で回す
・以下の順で加える
Tris hydroxymethyl aminomethane ——– 5.0 g
NaNO3 ——– 3.5 g
Na2-glycerophosphate ——– 500 mg
Fe stock solution * ——— 250 ml
P-2 metal mix ** ———- 250 ml
Vitamine B12 stock solution (0.1 mg / ml) —- 1.0 ml
Thiamine-HCl stock solution (1 mg / ml) —- 5.0 ml
Biotine stock solution (0.1 mg / ml) —- 0.5 ml
・pHを7.8に調整→DW 1000 mlにメスアップ→オートクレーブ(121℃,20分)→4 ℃で冷蔵保存
1Lボトル
ボトルは個人専用 シールを貼る
抗生物質
ペニシリンG(シマダ研DNA実験室冷蔵庫) (グラム陽性菌グラム陰性球菌に対しては強い抗菌作用を示すが、グラム陰性桿菌には効かない)真正細菌の細胞壁の主要成分であるペプチドグリカンを合成する酵素と結合し、その活性を阻害する
ストレプトマイシン(シマダ研DNA実験室冷蔵庫) (グラム陽性菌、グラム陰性菌の発育を阻止する)細菌のDNAから転写されたメッセンジャーRNAの遺伝情報を誤読させて、タンパク質の生合成を阻害する
通常は1L海水に対して各30mgづつ入れる
Wakoのペニシリン-ストレプトマイシン溶液は,1mlあたりペニシリン16mg(10,000units),ストレプトマイシン10mgが入っている
珪藻除去には二酸化ゲルマニウムを使用する
珪藻がSiの代わりにGeを取り込み、被殻ができなくなる
1N NaOH 200mL(NaOH 8gを200mlDWで溶かす)に二酸化ゲルマニウムを500mg入れ、オートクレーブ(121℃20分)
10N HCl (35%塩酸を4倍希釈)でpH10ぐらいまでさげ,1N HCl でpH8までさげる。
急激にpHを下げると白濁してしまうので、注意!
洗い物・乾熱滅菌
容器を3つシンクにならべ、左端に洗剤、残りは水道水で満たす
基本はスポンジとブラシを使用して洗剤で洗う。 2度すすぎをする。この時もスポンジとブラシを使用する。 最後は脱イオン水をかける。 乾燥させる。 翌日、かごに入れて乾熱滅菌(180度、1時間)
アオサ類の成熟誘導
大きめの元気そうな藻体(野外or20℃培養)を筆でクリーニング (海水:5cm直径ディスポシャーレ中)
別ディスポシャーレに移し、細かく刻む(2mm角)
そこにDW(海水)を適量入れて,ピンセットでしゃかしゃか混ぜる
静置して,藻体をしずめ,おおざっぱにすて,残りをピペットで吸う
これを2～3度繰り返す
適度に乾燥(室温 10分程度)
20℃の1～2倍PES海水を入れ,25℃に1～4日
その間,確認のみ
成熟が確認できたら,光を当てて集め,ピペットでエッペンに移し2000rpm2minで濃縮
- 成熟しない場合 PESヌキの滅菌海水に移す ライトで暖める(1晩つけっぱなしで,朝8時に消し,10時に放出例アリ)